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常见问题

ELISA试剂使用过程中常见问题解答
现象	可能原因	解决方法
（一）显色淡，灵敏度低	1、试剂盒没有按规定进行保存，受高温影响；	不要将试剂盒长时间置于常温下，按使用规定储藏。
	2、试剂盒超过有效期；	不要使用。
	3、试剂、样品用前未能平衡；	用前试剂、样品置室温平衡10分钟左右
	4、移液器计量不准，吸嘴内水份太多或不清洁；	校正移液器，移液器与吸嘴配合要紧密吻合。移液不宜太快，排放应完全。吸嘴最好一次性使用。
	5、培养箱温度不到37℃；	反应板放入培养箱时注意温度并及时调整。保温期内不宜多开门，以免影响保温。
	6、保温时间不够；	定时钟准确定时。
	7、洗涤冲击力太大。洗涤液浸泡时间太长，洗涤次数过多；	减小洗涤冲击力，按说明书要求置留洗涤液时间和洗涤次数。
	8、显色剂加量不足或顺序颠倒，或混合后加入；	滴加显色剂时，滴瓶垂直向下，持力均匀，滴速不宜过快，先加显色剂A，后加显色剂B，不可将A、B液混合后加入。
	9、底物作用时间不够；	准确定时。
	10、蒸馏水水质有问题；	测定蒸馏水配制试剂对酶免疫法的影响。
	11、样品用NaN3防腐，抑制了酶的反应；	样品中不能加入NaN3。
（二）重复性差	1、样品数量不一，加样时间长短不一；	重复某一样品时，加样时间尽可能与第一次接近。
	2、样品加入后未混匀；	加样后在混匀器上充分混匀。
	3、酶标仪滤光片不对或输入波长不对；	TMB显色用450/630波长.
	4、酶标仪测定重复性差；	校对酶标仪。
	5、洗涤不正确；	用洗涤液注满各孔，但不要溢出。洗板时反应板面向下，垂直用力甩净内容物（可多甩几次），在干净、无或少尘的吸水材料上拍干。洗板机洗板时不应有堵孔，洗涤应充分。
	6、温育条件不一致（一次用水育，一次用恒温箱）	恒温箱温育较水浴显色深，OD值高出0.1-0.15,最好均采用恒温箱.如用水浴水温应控制在37℃。
	7、不慎多加或少加酶或显色剂；	多加时显色深，少加则浅，用记号笔圈上，便于分析。
	8、阈值附近时阴时阳；	同一样品做三个复孔，以二个（含二个以上相同结果为准
	9、加样量不一致；	尽可能使用同一移液器和装紧吸嘴重复测定标本。条件、人员等应尽量与上次保持一致，以排除这些因素造成的不一致可能性。
	10、保温时间不一致；
	11、洗涤条件不一致；
	12、操作人员不一致；
（三）出现一片白，阳性对照不显色	1、蒸馏水有问题；	与好的蒸馏水比较。
	2、洗涤液配制不误；	按说明书配制。
	3、终止液误作洗涤液稀释；	每次配制时都应看清标签标明物质。
	4、终止液当底物缓冲液配制；	每次配制时都应看清标签标明物质。
	5、漏加酶；	注意不要漏加
	6、漏加显色剂A或B；	加显色剂后观察一个液面高度。
	7、某一容器未洗净，残留有灭活酶物质；	尽可能用试剂盒内容器，另觅的一定要洁净，可靠
（四）全部呈有色	1、水质问题；	防止蒸馏水污染。
	2、加酶量过多（如 50uL误认为100uL）或丙肝酶稀释时加量过多；	加酶前检查移液器调节量是否准确，稀释酶时思想要集中。
	3、培养箱温度超过37℃或酶结合物反应时间或底物显色时间超过；	放入板以前要检查培养箱的温度，准确定时。
	4、洗涤不充分，样品中有其他成残留，或有残留酶。	充分洗涤。
	5、底物配制时间过长、或底物污染；	底物应在酶反应完毕即将洗涤前5分钟配制，注意避光。
	6、该批样品放置时间过长，样品污染；	样品应保持新鲜，或低温保存，防止污染。
	7、移液嘴重复使用，未洗净或消毒不完全而用于加酶或底物；	移液嘴尽可能一次性使用。
（五）花板	1、操作不慎；	按说明书洗板，加样，显色。洗板尤为重要。
	2、洗板机堵孔，残留液较多，加洗液及抽吸洗液不均匀。	检查洗板机，并进行调整。
	3、样品离心处理不完全，反映孔内发生凝血或残留细胞成分；	充分离心，3000rpm6分钟以上。
（六）显色顺序前后不均	1、批样品量过大，加试剂时间过长，反映时间不一致；	采用多通道连续移液器以缩短加试剂时间或控制每批样品量。
1、不同厂家生产的试剂盒因生产工艺和操作方法略有不同，请用户务必按所用试剂盒说明书严格操作。否则易产生检测结果的不确定性。 2、若不同批号试剂的不同组分（A液或酶工作液），或不同试剂的不同组分进行交叉使用，有可能出现显色浅或本底高，花板等情况。 3、反应板出现一片白或一片有色（包括阴阳性对照），大多数是实验室中某一环节发生问题；若逐一排除可能性仍出现上述情况，可与另一批号试剂盒进行对照以排除试剂盒质量问题的可能性。